Mikrobiese groei kan plaasvind in opgebergde dieselbrandstof. Hierdie groei kan die latere benutting van die brandstof in voertuie en noodkragopwekkers beïnvloed deurdat dit brandstoffilters verstop. Verder kan ’n mutualistiese mikrobegemeenskap ontwikkel wat polisikliese aromatiese koolwaterstowwe (
Mikrobiese verwering is die afbraak van substrate deur mikroörganismes (Bento
Al hierdie genoemde eienskappe maak dit duidelik dat die groei en ontwikkeling van mikroörganismes in gestoorde brandstofprodukte bestudeer moet word. Wanneer die probleem gesien word in die huidige omstandighede waar gereelde kragonderbrekings en wisselende brandstofpryse gekoppel word aan pogings om brandstofgebruik te verminder, kan hierdie studie ’n bydra maak tot die beter langtermynopberging van diesel.
Diesel is ’n meer omgewingsvriendelike brandstof as petrol vanweë ’n hoër energie inhoud. Die hoeveelheid energie wat vrygestel word tydens ontbranding van diesel is hoër as dié van die ekwivalente petrolvolume. Dit beteken dat dieselaangedrewe voertuie verder kan ry met ’n liter brandstof. ’n Nadeel van diesel is dat dit afgebreek word tydens langtermynopberging wat die kwaliteit en werksverrigting daarvan beïnvloed. Die afbraak van diesel kan te wyte wees aan biotiese (mikrobiese groei) of abiotiese afbraak (oksidering, sameklomping, emulsievorming, ens.). Diesel is ’n vermenging van paraffien en aromatiese kool-waterstowwe en die afbraak daarvan vind gewoonlik plaas deur mikrobiese populasies wat meewerk om die komplekse voedselbron te benut (Richard & Vogel
Langtermynopberging van diesel kan die stabiliteit van die brandstof laat afneem (Stavinoha, Westbrook & LePera
’n Sleuteleienskap van mikrobiese groei is die teenwoor-digheid van water. Dit kan voorkom as ’n film op die oppervlak of verspreid binne die diesel of olie (Littman
Om die nie-kweekbare mikrobes in enige monster te bestudeer is dit nodig om na die DNS-profiele te kyk om verskillende spesies van mekaar te onderskei. Die gebruik van sogenaamde volgendegenerasie-DNS-basisvolgordebepaling vergemaklik die proses, maar dit vereis bioinformatika-ondersteuning wat duur is om te bekom. Verskeie tegnieke bestaan wat op meer tradisionele molekulêre tegnieke gebaseer is. Polimerasekettingreaksie-afbrekingsgradiënt-jelelektroforese (PKR-DGGE) (Muyzer, De Waal & Uitterlinden
Die identifikasie van mikrobes wat teenwoordig is in diesel sal help om dieselafbraak te voorkom deur strategieë te ontwikkel wat dieselafbraak kan voorkom. In hierdie studie word na beide die kweekbare en nie-kweekbare mikrobefraksies van kommersiële diesel, afkomstig vanaf verskillende vulstasies, gekyk. DGGE is gebruik om die -nie-kweekbare fraksie te ondersoek vir bakterieë wat oorleef in die diesel en moontlik ook kan aanwas. Hierdie studie kan bydra tot die kennis van bakteriële spesies wat gebruik kan word om bioremediëring van dieselbesoedelde grond in die toekoms aan te vul.
Diesel is verkry vanaf ses verskillende vulstasies rondom die Universiteit van Johannesburg. Die vulstasies berg elkeen van verskillende handelsmerke diesel. Om voldoende hoeveelhede bakteriële selle te bekom vir totale DNS-ekstraksie, is hoeveelhede van een liter volumes van die 500 dele per miljoen (dpm) swawelbevattende diesel gesentrifugeer in ’n Biofuge Stratos sentrifuge (Heraeus Instruments) teen 10 000 × g vir 20 min. Al die diesel is afgepipeteer en die totale DNS geëkstraheer deur gebruik te maak van die ZR Grondmikrobe-DNS-ekstraksiestel (Zymo Research) volgens hulle aanduidings. Die bakteriële populasie diversiteit is bepaal deur DGGE (Muyzer
Die steekproefneming is geskoei op klassieke studies wat monsters uit besoedelde grond geneem het. Bakterieë is direk geïsoleer vanuit 500 dele per miljoen (dpm) swawelbevattende diesel, asook deur reeksverdunnings (1 x 10−5 finale verduninng in 0.7% fisiologiese soutoplossing, FSO) van die diesel. Vir die neem van die direkte monsters is hoeveelhede van een liter van die diesel gesentrifugeer in ’n Biofuge Stratos sentrifuge teen 10 000 × g vir 20 min. Die gekompakteerde sediment is gehersuspendeer in 1000 μL FSO en 500 μL volumes uitgeplaat op GPY medium (Glukose 5 g l−1; peptoon, 10 g l−1; gisekstrak 5 g l−1; NaCl 5 g l−1; agar 15 g l−1; pH 7.2). Na die plate by kamertemperatuur geïnkubeer is (25 ºC), is die kolonies wat visueel verskillend gelyk het, opgetel en weer uitgestreep op GPY plate om reinkulture te verkry vir die opvolgende studies. GPY plate is gebruik om alle bakterieë te isoleer.
DNS is geïsoleer vanuit die bakterieë deur gebruik te maak van die Bloed-en- Weefselstel (Qiagen) sonder enige aanpassings van die protokol. Daarna is die DNS gebruik as templaat in ’n reaksie waarin ’n deel van die 16S rDNS-geen vermeerder is met die gekonserveerde inleiers 16F27 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) en 16R1485 (5’-TACCTTGTTACGACTTCACCCCA-3’) (Ben-Haim
Die basisvolgordes is geanaliseer teen die NCBI GenBank databasis deur ’n BLAST-analise te doen. Hierdeur is die datastel opgestel wat gebruik word om die filogenetiese verwantskappe van die verskillende bakteriële stamme te bepaal. Veelvoudige basisvolgordegroepering is gedoen met behulp van die MAFFT weergawe 5-program (Katoh
Die groei van ses bakteriële stamme is bepaal as staande kulture met diesel as die enigste koolstofbron. Dit is gedoen in 300 mL Bushnell-Haas media (0.20 g l−1 MgSO4, 0.02 g l−1 mM CaCl2, 1 g l−1 KH2PO4, 1 g l−1 K2HPO4, 1 g l−1 NH4NO3, 0.05 g l−1 FeCl3, pH 7) (Bushnell & Haas
Die amplifisering van die 16S rDNS PKR het amplifi-seringsprodukte met die verwagte lengtes opgelewer (ca. 500 basispare, bp) vir al ses van die dieselmonsters. Die fragmente is geskei deur middel van DGGE om die verskillende profiele vir die onderskeie dieselmonsters waar te neem (
Voorlopige identifikasie van die denatureringsgradiënt jelelektroforese-bande. Die identifikasie is gebaseer op die basisvolgordes van die bande wat deur die nBLAST-funksie teen die GenBank databasis gesif is.
Band | Monster | Voorlopige identifikasie | E-waarde | Persentasie-homologie |
---|---|---|---|---|
1 | A | KFSO545O - Ongekweekte |
O | 1OO |
2 | A | KJ437449 - |
O | 1OO |
3 | B | KF479594 - |
5.OOE-137 | SS |
4 | B | KF479594 - |
O | 98 |
5 | B | KC6O6193 - Ongekweekte bakteriële kloon CS biofilm | O | 97 |
6 | B | KJSO94O6 - Ongekweekte bakteriële kloon BVESI5G114 | 4.OOE-167 | 92 |
7 | B | KJSO94O6 - Ongekweekte bakteriële kloon BVESI5G114 | O | 98 |
S | B | NR_O2S7S7 - |
2.00E-165 | 98 |
9 | D | AB69S715 |
O | 99 |
1O | B | JF9O5621 |
4.OOE-12O | 1OO |
Denatureringsgradiënt jelelektroforese-profiele van die 16s rDNS-operon wat geamplifiseer is van totale DNS geïsoleer vanuit die ses dieselmonsters.
Ses bakteriële stamme is vanuit die dieselmonsters geïsoleer. Hierdie stamme is gesuiwer om reinkulture te verkry en is verder gekarakteriseer ten opsigte van die 16S rDNS operon. Dit het basisvolgorde data gelewer wat vergelyking met die GenBank- databasis moontlik gemaak het om die voorlopige identifikasie van die stamme te bewerkstellig (Tabel 2). Dié voorlopige identifikasie is gebaseer op basisvolgorde ooreenkomste en is gebruik in ’n filogenetiese analise om hulle finale verwantskap met ander bakteriële spesies te bepaal. Drie van die geïsoleerde stamme het sterk verwantskap getoon aan verskillende stamme van
Die ses stamme is ook verder ondersoek vir hulle groei op diesel as enigste koolstofbron. Al die stamme, buiten stam A, het dieselfde groeipatroon vertoon (
Groei van die geïsoleerde bakterieë op diesel as enigste koolstofbron. Groei word vir 14, 21, en 28 dae na inokulasie aangedui. Die standaardfout word deur die balkies aangedui, data word voorgedra van drie herhalings van die eksperiment.
Voorlopige identifikasie van die geïsoleerde bakteriële stamme gebaseer op die nBLAST-analise van die GenBank databasis.
Stam | Voorlopige identifikasie | E-waarde | Persentasie-homologie |
---|---|---|---|
A | KC153292 - |
0 | 98 |
B | AB301015 - |
0 | 99 |
C | DQ298259 - Ongekweekte bakterium | 0 | 100 |
D | EU327994 - |
0 | 99 |
E | DQ979413 - |
0 | 99 |
F | AB244484 - |
0 | 99 |
’n Parsimonie-analise van die saamgevoegde basisvolgordes van die 16S rDNS is gedoen om die filogenetiese verwantskappe tussen die geïsoleerde stamme en data afkomstig vanaf GenBank te bepaal. Basisvolgordegroepering van die 53 taksa het gelei tot die insluiting van 1628 parsimonies-insiggewende karakters in die analise en het verder gelei tot die opstel van 100 mees parsimoniese bome vir die datastel. Een hiervan word voorgestel (CI: 0.5962, homoplasie-indeks, HI: 0.4038, RI: 0.8357) (
Maksimum parsimoniese analise van die 16S rDNS-operon vir beide die kweekbare en nie-kweekbare fraksies. Steekproefhersteekproefnemings word aangedui bo die takke in vetdruk. Subfilums word aangedui deur die hakies langsaan die boom.
Dit het bakterieë van die α- en die β-Proteobakterieë ingesluit. ’n Enkele nie-kweekbare stam het gegroepeer met
In hierdie studie is bakterieë geïsoleer vanuit gestoorde kommersiële diesel om die populasie samestelling te bepaal. Ses stamme is geïsoleer vanuit die kweekbare deel en ’n verdere tien stamme geïdentifiseer vanuit die nie-kweekbare studie van die diesel. Die lae getalle bakteriële stamme wat in die studie geïsoleer is stem ooreen met ander studies wat op dieselbesoedelde omgewings gedoen is (Al-Mailem, Kansour & Radwan
Die gebruik van DGGE om die populasie samestelling van bakterieë in diesel te bepaal het tot meer inligting gelei as om net die kweekbare fraksie te bekom. Verskeie bande het as dubbelbande uitgekom tydens die amplifisering daarvan nadat dit uit die jel gesny is. Dit dui dus wel dat skeiding nie gelei het tot volledige bepaling van die populasiestruktuur nie. Hierdie faktor tesame met die ooreenstemming van verskeie bande tussen die profiele dui dus op ’n onderbepaling van die populasie in diesel gevind. Dit sal dus waardevol wees om van die dieselmonsters te onderwerp aan volgende generasie volgordebepaling om die omvang van die populasie beter te bepaal. ’n Nadeel van so ’n studie is natuurlik die inleierpartydigheid tydens omgewingsmonsters se amplifisering met behulp van PKR (Bokulich & Mills
Die verskille tussen die DGGE-profiele kan nie verduidelik word aan die hand van ’n enkele veranderlike nie. Geografiese ligging van die brandstofverkopers, byvoegings tot die verskillende handelsmerke diesel, asook die gebruik van onderskeie vervoermaatskappye (en moontlik verskillende tenkwaens van dieselfde maatskappy) om die brandstof vanaf die raffinaderye in Suid-Afrika te vervoer kan alles bydra tot die vestiging van bakteriële populasies. Dus kan hierdie veranderlikes die vestiging van mikrobe populasies net soveel beïnvloed as wat die stoortydperk daarvan by die eindpuntvulstasie of opbergingstenk kan doen. Dit sal interessant wees om diesel van dieselfde handelsmerk en raffinadery aan te koop by vulstasies wat vêr verwyder is, om die invloed van die eersgenoemde veranderlikes te bestudeer. Dit mag nuwe lig werp op die verandering in die populasiesamestelling en kan aandui wat die invloed van die geografiese ligging van die eindpuntvulstasie of die vervoer en oorsprong van die diesel bydra tot hierdie verskillende profiele. Geografiese ligging het die meeste bygedra tot populasiesamestelling in petroleum
Die oorgrote meerderheid van bakteriële groei kan -waar-geneem word as slyk op die bodem van opbergingstenks. Hierdie groei vind plaas by lae suurstofkonsentrasies, aangesien opbergingstenkse nie ontwerp is om gasuitruiling tussen die omgewing en die tenk te bevorder nie. Lae suurstofoplosbaarheid is ’n verdere hindernis vir aerobe mikrobiese groei in opbergingstenks. Suurstof kan redelik maklik oplos in beide diesel en water en dit kan mikrobe groei bevorder as die vlakke daarvan voldoende is. In lae suurstofkonsentrasies sal dit die groei van anaerobe en fakultatiewe anaerobe ook bevorder. Slegs aerobe en fakultatiewe anaerobewasanaerobe is met DGGE bespeur en dit dui moontlik daarop dat voldoende suurstof in die diesel opgelos is om dié soort groei aan te moedig. Die voorkoms van die soort mikrobes in petrochemiese brandstof is welbekend en dra by tot die oksidering van brandstof en die opbergingstenk wat die gehalte verlaag (Chesnau 1987). Verder sal slegs aerobe respirasie tot die vorming van water lei.
Verskillende bakteriële stamme is vanuit die diesel geïsoleer, of hulle identiteit is deur DGGE en basisvolgordebepaling bevestig. Hierdie analises het lig gewerp op die populasie samestellings van beide die kweekbare en nie-kweekbare bakteriële fraksies van die diesel. Die feit dat al die geïsoleerde bakterieë wel op diesel as enigste koolstofbron kan groei dui aan dat hulle wel kan bydra tot die biotiese afbraak van diesel tydens opberging. Selfs al vind die afbraak stelsematig plaas, kan dit die werksverrigting van dieselenjins nadelig beïnvloed. Die vinnige groei van stam A op diesel as koolstofbron sal verder ondersoek moet word, aangesien dit ’n moontlike rol sal kan speel in die bioremediëring van dieselbesoedeling.
Die outeurs erken finansiële ondersteuning van Eskom Holdings Bpk.
Die outeurs verklaar dat hulle geen finansiële of persoonlike verhouding(s) het wat hulle op ’n voordelige of nadelige wyse by die skryf van die artikel beïnvloed het nie.
E.V. was die projekleier, E.V. en A.J. het die eksperimentele ontwerp en data-analises gedoen, terwyl P.S. en N.v.d.H. verantwoordelik vir eksperimentele uitvoering en data-insameling was.