About the Author(s)


Moraba M. Meelah
Phytomedicine Programme, Department of Paraclinical Sciences, University of Pretoria, South Africa

Health Sciences Research Office, Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, South Africa

Ladislaus K. Mdee
Phytomedicine Programme, Department of Paraclinical Sciences, University of Pretoria, South Africa

Department of Pharmacy, University of Limpopo, South Africa

Jacobus N. Eloff Email symbol
Phytomedicine Programme, Department of Paraclinical Sciences, University of Pretoria, South Africa

Citation


Meelah, M.M., Mdee, L.K. & Eloff, J.N., 2017, ‘Fraksies en geïsoleerde verbinding uit Tecoma stans (Bignoniaceae), ’n indringerplant, het belowende aktiwiteit teen fungus fitopatogene’, Suid-Afrikaanse Tydskrif vir Natuurwetenskap en Tegnologie 36(1), a1496. https://doi.org/10.4102/satnt.v36i1.1496

Note: This article is partially based on the author’s dissertation to the Phytomedicine Programme in the Department of Paraclinical Sciences, for the degree of Magister Scientiae at the University of Pretoria, South Africa, with supervisors Prof. J.N. Eloff and L.K. Mdee, received December 2008, available here: https://repository.up.ac.za/bitstream/handle/2263/23195/dissertation.pdf?sequence=1

Oorspronklike Navorsing

Fraksies en geïsoleerde verbinding uit Tecoma stans (Bignoniaceae), ’n indringerplant, het belowende aktiwiteit teen fungus fitopatogene

Moraba M. Meelah, Ladislaus K. Mdee, Jacobus N. Eloff

Received: 23 Oct. 2017; Accepted: 06 Nov. 2017; Published: 12 Dec. 2017

Copyright: © 2017. The Author(s). Licensee: AOSIS.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Opsomming

Fungi wat plante aanval, lei tot groot verliese in plantproduksie en ook tot verliese in opbrengs nadat die produkte geoes is. Die beheer van hierdie fungi deur chemiese fungisiede lewer komplikasies vanweë menslike en omgewingstoksisiteit. Die koste en die ontwikkeling van weerstand deur plantpatogeniese fungi teen fungisiede lewer ook probleme. Sekondêre plantmetaboliete het ‘n goeie potensiaal as antifungusverbindings. Die doel van die studie was om die aktiwiteit van Tecoma stans-ekstrakte en - fraksies te bepaal en om die aktiewe verbinding te isoleer deur die bioaktiwiteit van fraksies gedurende die fraksionering te bepaal. Die dichlorometaanfraksie het die hoogste aktiwiteit gehad en die geïsoleerde verbinding se struktuur is bepaal as oleanolsuur. Die antifungusaktiwiteit is teen tien belangrike plantfunguspatogene bepaal (Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Collectotrichum gloeosporoides, Fusarium oxysporium, Penicillum expansum, Penicillum janthinellum, Pythium ultimum, Phytophthora nicotiana, Trichoderma harzianum en Rhizoctonia solani). Die gemiddelde minimum inhiberende konsentrasie was 130 μg/mL. Die DCM-ekstrak en oleanolsuur was minder toksies as die positiewe kontrole berberien teen Vero-selle met LC50 waardes van 0.413 mg/mL, 0.129 mg/mL en 15.48 μg/mL onderskeidelik. Die selektiwiteitindeks van 20 met verskeie fungi dui op moontlike relatiewe veiligheid om onder gekontroleerde toestande selfs vir eetbare produkte te gebruik. Die groot massa plantmateriaal wat van hierdie indringerplant beskikbaar is, mag tot ‘n kommersieel bruikbare produk lei in die bekamping van fitopatogeniese fungi.

Navorsing korrelasie: Hierdie artikel is die vertaalde weergawe en is beskikbaar gestel om ‘n breër lesersgroep te bereik. Die oorspronklike Engelse artikel is beskikbaar hier: https://doi.org/10.4102/satnt.v36i1.1489

Abstract

Tecoma stans (Bignoniaceae), leaf extracts, fractions and isolated compound have promising activity against fungal phytopathogens. Plant pathogenic fungi are a major cause of reduced plant production and post-harvest losses of plant produce. The control of these fungi by some synthetic fungicides is complicated by human and environmental toxicity, the development of resistance by some fungi and high costs, thus prompting the investigation of other means of fungal control. Plant secondary metabolites have a good potential as antifungal agents. The aim of this study is to investigate the potential use of Tecoma stans as a plant-derived fungicide by determining the antifungal activity of extracts, isolating the bioactive compound and testing the toxicity of both the extract and the isolated compound. In bioassay-guided fractionation of the leaves of the T. stans dichloromethane (DCM) extract contained one major compound that was isolated and characterised as oleanolic acid. The DCM extract and oleanolic acid were active against 10 tested plant fungal pathogens (Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Collectotrichum gloeosporoides, Fusarium oxysporium, Penicillum expansum, Penicillum janthinellum, Pythium ultimum, Phytophthora nicotiana, Trichoderma harzianum and Rhizoctonia solani) with an average minimal inhibitory concentration of 130 μg/mL. The DCM extract and oleanolic acid were toxic to Vero cells with an LC50 of 0.413 mg/mL and 0.129 mg/mL respectively, when compared with berberine, a toxic compound with LC50 of 15.48 μg/mL. Oleanolic acid was more toxic than the crude extract, supporting the potential use of plant extracts for controlling plant fungal pathogens. The selectivity indices of 20 with several fungi indicated that extracts could possibly be used under controlled conditions against infections of certain fungal pathogens, even on edible plants. The large quantities available of this invasive plant species could lead to a commercially useful product in controlling plant fungal pathogens.

Research correlation: This article is the translated version, made available to provide access to a larger readership, of which the original English article is available here: https://doi.org/10.4102/satnt.v36i1.1489

Inleiding

Patogeniese fungi in plante bedreig voedselsekuriteit wêreldwyd terwyl meer as 800 miljoen mense nie genoeg kos het nie en ten minste 10% van die kos wat geproduseer word as gevolg van aanvalle deur mikroorganismes verlore gaan (Strange & Scott 2005). Een belangrike oorsaak van plantsiektes is patogeniese fungi (Prescott, Harley & Klein 1996). Wanneer oeste deur sekere patogeniese fungi geïnfekteer word, stel hulle mikotoksiene vry wat vir sowel mense as lewende hawe skadelik is (Awuah & Kpodo 1996)

Sintetiese swamdoders is die belangrikste manier om plantpatogene te beheer. Veiligheidsrisiko’s, die hoë koste, newe-effekte en die ontwikkeling van weerstandigheid jeens die gebruik van hierdie fungisiede wek egter ernstige kommer (Tripathi & Dubey 2004). Hierdie nadeel het aanleiding gegee tot die ondersoek na ander maniere om fungi te beheer.

Plante is goeie kandidate vir die soektog na swamdodende verbindings aangesien hulle soms onder moeilike omstandighede bestaan en deur verskillende organismes, veral fungi, aangeval word (Hostettman et al. 2000). Daar is ‘n toenemende motivering om sintetiese antimikrobiese middels met natuurlike middels te vervang (Sharma & Tripathi 2006). Plantekstrakte of plant sekondêre metaboliete uit plante wat nie giftig is nie en spesifiek is in hulle werking kan dus as alternatiewe vir sintetiese swamdoders oorweeg word. Op grond van die beskikbare materiaal het ons besluit om T. stans te ondersoek.

Tecoma stans, wat ook as die floridavlier bekend staan, is ’n lid van die Bignoniaceae-familie. Hierdie aantreklike tropiese struik kom hoofsaaklik in Sentraal- en Suid-Amerika voor hoewel die natuurlike verspreiding vanaf die suidelike state van die Verenigde Sate van Amerika (VSA) tot in die noorde van Argentinië strek. T. stans het egter ook in ander tropiese en subtropiese streke in Afrika, Asië, die Stille-Oseaan-eilande en Australië as indringerplant gevestig geraak. T. stans is ’n droogtebestande struik wat redelik weerstandig is teen peste (http://cloudbridge.org/trees/tecomastans.html).

Die blare, bas en wortels van T. stans word vir ’n verskeidenheid medisinale doeleindes as kruiegeneesmiddel aangewend (http://cloudbridge.org/trees/tecomastans.html). In Meksiko word die plant tradisioneel dikwels in die beheer van diabetes gebruik. Blaarekstrak van die plant het vastende hase se bloedsuiker verlaag (Hammouda, Rashid & Amer 1964). Die plant bevat monoterpeen alkaloïede en twee van hierdie verbindings (tekomien en tekostanien) is vir die plant se hipoglisemiese aktiwiteit verantwoordelik (Hammouda & Amer 1966). Ons kon geen inligting in die literatuur kry oor die plant se antifungus aktiwiteit nie. Dit laat dus ruimte vir hierdie studie om inligting oor die moontlike antifungus gebruik te bied.

Ons het in hierdie studie die belangrikste antifungus verbinding in die plant geïsoleer en gekarakteriseer. Ons het ook die antifungus aktiwiteit teen belangrike patogene in plantfungi bepaal, asook die sitotoksisiteit van die verbinding.

Materiaal en metode

Plantversameling

Blare van T. stans is in die somer by die Laeveld Nasionale Botaniese Tuin in Mbombela, Suid-Afrika, versamel. Die blare is gedroog deur hulle in die skaduwee met goeie ventilasie in oop maassakkies, waarin lemoene verkoop word, op te hang. Die identiteit van die spesie is bevestig deur ‘n herbariumeksemplaar.

Ekstraksie

Verpoeierde gedroogde blare van T. stans is drie keer met asetoon in ’n verhouding van 10:1 ge-ekstraheer. Die asetoon is by kamertemperatuur onder ’n stroom lug in ’n dampkas verwyder. Die ekstrak is geberg in gemerkte houers wat vooraf geweeg is om die effektiwiteit van die ekstraksie te kwantifiseer. Asetoon is as ekstraktant gebruik op grond van die effektiwiteit daarvan om ’n groot hoeveelheid en verskeidenheid verbindings te ekstraheer, die gemak om dit te verwyder uit die ekstrak, veiligheid en lae toksisiteit teen bioessajeerorganismes (Eloff 1998a).

Oplosmiddel-oplosmiddel fraksionering van ongesuiwerde ekstrak

Oplosmiddel-oplosmiddel ekstraksie is ’n gewilde tegniek wat gebruik word om monsters vir kwalitatiewe en kwantitatiewe ontleding voor te berei. Dit is ’n proses waar een bestanddeel van ’n mengsel geskei word deur dit op te los in ’n oplosmiddel waarin dit oplosbaar is, terwyl ander konstituente nie oplosbaar is nie of ten minste minder oplosbaar is (Holden 1999). Die ongesuiwerde ekstrak van T. stans in asetoon is afsonderlik in metanol en 20% gedistilleerde water in ’n skeidingstregter (2000 mL) opgelos en toe met heksaan (Heks), dichrolometaan (DCM), etielasetaat (ETOAc) en n-butanol (BuOH) geskei, in hierdie volgorde. Hierdie oplosmiddels het wisselende polariteite om verskillende bestanddele van die plant met verskillende polariteite te skei. Die chemiese samestelling (deur dunlaagchromatografie), die aantal antifungus verbindings (deur bio-outografie), die antifungus aktiwiteit (deur reeksverdunning op ’n mikroplaat) en die sitotoksisiteit teen Vero-selle van die vier fraksies is bepaal.

Bio-outografie

’n Bio-outografiese metode wat in ons laboratorium ontwikkel is (Masoko & Eloff 2005), is gebruik om aktiwiteit te bepaal. Dunlaagchromatografieplate is voorberei en gelaai met ekstrak en oleanolsuur wat in ’n finale konsentrasie van 10 mg/mL en 1,0 mg/mL onderskeidelik opgelos is. Tien mikroliter daarvan is aangewend en die plate is in ’n mobiele fase ontwikkel, gedroog en met swamorganismes gespuit totdat dit net-net nat was. Die plate is oornag geïnkubeer en toe met ’n oplossing van 2 mg/mL p-jodonitrotetrasolium violet (Sigma®) (INT) gespuit. Dit is weer oornag of langer by 35 °C in 100% relatiewe humiditeit en in die donker geïnkubeer. Wit areas het aangedui waar die reduksie van INT na die gekleurde formasaan nie plaasgevind het nie omdat daar verbindings was wat die groei van die fungi in die toets geïnhibeer het. Ten einde die verspreiding van en infeksie met fungi in ons laboratorium te beperk, is die bio-outogramme in deurskynende plastiekkoeverte verseël voordat dit vir ’n permanente rekord inskandeer is. Die Rf-waarde van aktiewe verbindings is bereken deur die volgende formule te gebruik:

Rf = afstand deur verbinding beweeg/afstand deur oplosmiddelfront beweeg

Die bepaling van antifungus aktiwiteit deur ’n reeksmikroverdunningstoets

Die mikroverdunningsmetode wat deur Eloff (1998b) ontwikkel en deur Masoko, Picard en Eloff (2005) gewysig is, is gebruik om die minimum inhiberende konsentrasie (MIK)-waardes van T. stans ekstrakte, fraksies en geïsoleerde verbindings teen 10 patogeniese plantfungi te bepaal, naamlik Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporium, Penicillum janthinellum, Penicillum expansum, Aspergillus parasiticus, Aspergillus niger, Collectotrichum gloeosporoides, Frinoderma wallianum, Cyathium optimum en Phytophthora nicotiana. Die metode is soos volg toegepas.

Die gedroogde DCM-ekstrak van T. stans, fraksies en oleanolsuur is in asetoon opgelos teen ’n konsentrasie van 10 mg/mL en 1 mg/mL onderskeidelik. Die DCM-ekstrak van T. stans en oleanolsuur (100 μL) is in ’n reeksverdunning met 50% water in ’n 96-bron miktrotiterplaat verdun (Eloff 1998b). Swamkulture is in ’n vars dekstrose aartappel groeimedium oorgeplaas en 100 μL hiervan is by elke bron gevoeg. Amfoterisien B is as die verwysingsantibiotikum en positiewe kontrole gebruik en die negatiewe blanko kontrole vir die oplosmiddel, asetoon is ingesluit. As groei-aanduider is 40 μL 0.2 mg/mL INT wat in water opgelos is by elk van die mikroplaatputjies gevoeg. Die eksperiment is in triplikaat uitgevoer en drie maal herhaal. Die minimum inhiberende konsentrasie (MIK) is aangeteken as die laagste konsentrasie-ekstrak wat antifungus groei na 24 h se inkubasie geïnhibeer het. Asetoon is as oplosmiddel en negatiewe kontrole gebruik omdat fungi nie deur asetoonkonsentrasies van laer as 50% beïnvloed word nie (Eloff, Picard & Masoko 2007). Die hoogste asetoonkonsentrasie waaraan die fungi in hierdie prosedure blootgestel is, was 25% in die eerste putjie.

Sitotoksisiteit bepaling

Die monsters se sitotoksisiteit teen die Vero-niersellyn in ape (wat van die Departement Tropiese Dieresiektes, Universiteit van Pretoria, verkry is) is getoets. Die selle is in minimale noodsaaklike medium (Highveld Biological, Johannesburg, Suid-Afrika) onderhou. Dit is met 0.1% gentamisien (Virbac) en 5% fetale kalfserum (Adcock-Ingram) aangevul. Die selle is vir die toets voorberei deur selsuspensies uit samevloeiende monolaagkulture voor te berei en dit teen ’n digtheid van 0.5 x 103 selle in elke putjie in die 96-put mikrotiterplaat te plaas. Nadat dit oornag teen 37 °C in ’n 5% CO2-inkubeerder inkubeer is, is die subsamevloeiende selle in die mikrotiterplaat in die sitotoksisiteitstoets gebruik. Verdunnings van die plantekstrak is in groeimedium (1 μg/mL tot 1000 μg/mL) voorberei. Die lewensvatbare selgroei na 120 h se inkubering met plantekstrakte/monsters is bepaal deur die tetrasoliumgebaseerde kolorimetriese toets (MTT-toets) wat deur Mosmann (1983) beskryf is, te gebruik. Die absorpsie is op ’n Titertek Multiscan MCC/340 mikroplaatleser teen ’n toetsgolflengte van 540 nm en ’n verwysingsgolflengte van 690 nm gemeet. Berberienchloried (Sigma Chemical Company) is as positiewe kontrole gebruik. Toetse is in viervoud uitgevoer en elke eksperiment is vier maal herhaal.

Die isolering van bioaktiewe verbindings

Die DCM-ekstrak wat uit die oplosmiddel-oplosmiddel ekstraksie verkry is, is op silikajel 60 aan kolom-chromatografie onderwerp. Die kolom is met 100% DCM uitgeloog en die polariteit van die loogmiddel is daarna deur die byvoeging van metanol (MeOH) verhoog. Aanvanklik is 1000 mL 100% DCM gebruik, gevolg deur mengsels van 10% MeOH, 20% MeOH, 30% MeOH, 40% MeOH, 50% MeOH, 60% MeOH, 80% MeOH, almal in DCM. Laastens is die kolom met 100% MeOH uitgewas. Altesaam nege fraksies van 1000 mL is versamel. Fraksies is volgens die in samestelling op dunlaagchromatogramme saamgegroepeer. Die fraksies is gekonsentreer en gechromatografeer om onsuiwerhede te verwyder ten einde die aktiewe verbinding te verkry. Ten einde te bevestig dat die isolering van die antifungus verbinding in die ekstrak nie ’n artefak van die isoleringprosedure was nie, is bio-outografie op die geïsoleerde verbinding en die ongesuiwerde ekstrak in DCM uitgevoer.

Kernmagnetiese resonansiespektroskopie

Kernmagneetresonansiespektroskopie (1H NMR en 13C NMR) is met ’n Varian Inva 400 MHz-spektrometer gedoen om die struktuur van die verbinding te bevestig. Die geïsoleerde verbinding uit T. stans is gedroog en c. 15 mg is in NMR-buise in 2 mL gedeutereerde chloroform opgelos. Die analise is in die Departement Chemie aan die Universiteit van Botswana ontleed.

Resultate en bespreking

Die hoeveelheid Tecoma stans wat onttrek is deur oplosmiddel-oplosmiddel ekstraksie te gebruik

Die 46, 67 g, asetoonekstraktevan verpoeierde T. stans-blare is aan oplosmiddel-oplosmiddel ekstraksie onderwerp. Dit het tot vier fraksies met toenemende polariteit gelei, naamlik heksaan, DCM, EtOAc en BuOH. Heksaan was die beste ekstraktant wat betref die hoeveelheid wat onttrek is met 46, 23% (21, 58 g), gevolg deur DCM met 16, 75% (7, 82 g), EtOAc met 1, 79% (0.84 g) en BuOH met 0.64% (0.3 g) onderskeidelik. Dit dui aan dat blare van hierdie spesie hierdie baie ryk is aan nie-polêre verbindings.

Die dichlorometaan(DCM)-fraksie, wat die hoogste aktiwiteit gehad het,is gekies om aktiewe verbindings deur ’n biotoetsgerigte fraksionering te isoleer. Fraksies wat in ’n oopkolom silikajelchromatografie uit die DCM-ekstrak gewas is, is volgens hulle DLC-samestelling sgekombinaar, gekonsentreer en gechromatografeer om onsuiwerhede te verwyder. Dit het ’n wit suiwer presipitaat gelewer. Die aantal aktiewe van antifungus verbindings is ondersoek deur ’n bio-outografie van dunlaag chromatogramme met ’n suspensie P. janthelium konidia te spuit (Figuur 1).

FIGUUR 1: Chromatogram en bio-outogram van die dichlorometaan-fraksie wat met benseen:etanol:amoniumhidroksied 90/9/1 (1) ontwikkel is en die verbinding wat uit die ekstrak (2) geïsoleer is, wat met vaniliensuur-swawelsuur(a) en ’n konidia suspensie van Penicillum expansum gevolg deur p-iodonitrotetrasolium violet (b) gespuit is.

Die Rf-waarde van aktiewe verbindings kan dalk help om die isolering van antifungus verbindings uit ander plantekstrakte te derepliseer. Die Rf-waarde van die ekstrak- en geïsoleerde verbindings was 0.08 met BEA (bensien:etanol: amoniumhidroksied 90/9/1) (Kotze & Eloff 2002) as loopmiddel (Figuur 1). Dit bevestig dat die verbinding wat geïsoleer is waarskynlik die antifungus verbinding was wat in die ruekstrak teenwoordig was en nie ’n artefak van die isolasieproses nie.

Die identifisering van die verbinding

Die verbinding is as ’n wit presipitaat geïsoleer. NMR-spektroskopie het die verbinding as oleanolsuur geïdentifiseer (Figuur 2 en Figuur 1-A1). Oleanolsuur is ’n triterpenoïed verbinding wat in die blare en bas van baie plantsoorte teenwoordig is. Hierdie isomeer van ursolsuur is bekend daarvoor dat dit lewerbeskermende, anti-inflammatoriese en antihiperlipidemiese eienskappe het. Daar is ook onlangs bevind dat dit die bevordering van tumors teenwerk. Dit word in Sjina as ’n orale geneesmiddel vir menslike lewerongesteldhede bemark (www.alibaba.com/product-gs/203129384/Oleanolicacid.html). Die verbinding is baie bekend, maar die literatuur bied min inligting oor die antifungus aktiwiteit daarvan. Dit is nog nie vantevore uit T. stans geïsoleer nie.

FIGUUR 2: Die struktuur van oleanolsuur wat uit die dichorometaanfraksie van Tecoma stans blare geïsoleer is.

Antifungusaktiwiteit en bepaling van sitotoksisiteit
Bio-outografie

Wanneer ’n mens bioaktiewe verbindings uit plantekstrakte isoleer, is dit altyd moontlik dat die belangrikste aktiewe verbindings deur die isoleringsproses onaktief gemaak kan word en dat ’n minder aktiewe verbinding op die ou einde geïsoleer kan word. Om hierdie moontlikheid uit te skakel, is bio-outografie op die ruekstrak en die geïsoleerde oleanolsuur gedoen.

Die resultate van die bio-outografie (Figuur 1) dui aan dat die swamgroei deur die ekstrak en die oleanolsuur deur verbindings met dieselfde Rf-waarde geïnhibeer is. Dit is aangedui deur ’n helder sone wat die gevolg is van INT wat nie deur die aktief-groeiende organismes tot die rooi produk gereduseer is nie. Die twee identiese bande wat in die chromatografie van die ruekstrak en oleanolsuur waargeneem is, toon dat die aktiewe verbinding onveranderd uit die ekstrak geïsoleer is omdat albei dieselfde Rf-waarde van 0.08 in BEA gehad het. Dit bevestig die teenwoordigheid van oleanolsuur uit die ruekstrak.

Mikroverdunningstoets

Om die mate waartoe die aktiwiteit toegeneem het deur die oleanolsuur te isoleer asook die sensitiwiteit jeens verskillende swampatogene te evalueer, is die MK teen verskeie patogene bepaal (Tabel 1).

TABEL 1: MIK-waarde in μg/mL van Tecoma stans se dichlorometaan rufraksie en oleanolsuur wat teen 10 patologiese fungi in plante getoets is.

Daar was verskeie gevalle waar die T. stans se ruekstrak dieselfde MIK’s of selfs laer MIK’s as oleanolsuur gehad het (Figuur 1). Die mikro-organismes het verskillend op die ekstrak en die geïsoleerde verbinding reageer. P. janthinellum en C. glaeospariodes was relatief weerstandig, terwyl T. harzianum, R. solani, F. oxysporium en P. expansum relatief sensitief was. Die ekstrak se aktiwiteit teen van die fungi met MIK-waardes van 20 μg/mL en 60 μg/mL was goed. In die geval van P. expansum was die ekstrak se aktiwiteit beter as die van die positiewe kontrole, amfoterisien B. Die verskil in aktiwiteit teen verskillende fungi kan betekenisvol wees en selektiwiteit aandui omdat verskillende teikens aangespreek is.

Omdat die aktiwiteit van die ekstrak vergelykbaar was met die aktiwiteit van die verbinding beteken dit dat die aktiwiteit nie honderdvoudig vermeerder het nie, ten spyte van die feit dat ongeveer 99% van die ‘sogenaamde onaktiewes’ uit die ruekstrak verwyder is. Die analise is deur bio-outografie van dieselfde massa gedoen. Die mees waarskynlike verduideliking hiervoor is dat daar ’n groot mate van sinergisme moes plaasgevind het. Die verbindings wat sinergisties optree, was nie as sodanig aktief nadat hulle tydens bio-outografie van ander verbindings geskei is nie. ’n Ander moontlike verduideliking is dat ander vlugtige verbindings in die ruekstrak teenwoordig kon gewees het en dat hulle verdamp het tydens die lang tydperk waartydens die oplosmiddel van die chromatogramme verwyder is voordat dit met die fungi gespuit is. Alternatiewelik kon van die antifungus verbindings tydens die isoleringsproses vernietig gewees het.

Amfoterisien B was aktief met ’n gemiddelde MIK-waarde van 18 μg/mL, maar in sommige gevalle het die onsuiwer ekstrak ’n hoër aktiwiteit teenoor sekere fungi getoon as amfoterisien B. Dit dui daarop dat ruekstrak moontlik gebruik kan word om plante teen sekere fungi te beskerm.

As die gevolgtrekking waartoe ons in die vorige paragraaf gekom het, korrek is, naamlik dat daar substansiële aktiwiteit in die verbinding buite oleanolsuur geleë moet wees, kan ’n mens die algehele aktiwiteit van die ruekstrak en die geïsoleerde verbinding bereken (Eloff 2004) (Tabel 2). Dit bring nie net die antimikrobiese aktiwiteit in berekening nie, maar ook die massa daarvan en word bereken deur die MIK in mg/mL te deel met die totale massa in mg. Die waarde in mL dui aan die volume waartoe die massa verdun kan word en steeds die patogeen se groei inhibeer. As al die aktiwiteit van die geïsoleerde verbinding afkomstig is, behoort die twee waardes dieselfde te wees. Die waarde vir die ekstrak was egter 6.5 maal groter as die van die geïsoleerde verbinding. Selfs as net 50% van die aktiewe verbinding uiteindelik geïsoleer is van die res wat in rufraksies geleë is, verteenwoordig dit net ’n derde van die aktiwiteit wat in die ruekstrak plaasgevind het. Daar kan twee verduidelikings hiervoor wees. Moontlik, het die ander aktiewe verbindings tydens die isoleringsproses verdamp, ontbind of is dit onaktief gemaak. Aan die ander kant, en meer waarskynlik, omdat die bio-outografie aangetoon het dat daar net een antifungus verbinding in die ruekstrak was, het meer as een verbinding wat nie as sodanig aktief was nie deur sinergisme ’n rol gespeel om die antifungus aktiwiteit te bepaal.

TABEL 2: Totale aktiwiteit van die dichlorometaanfraksie en oleanolsuur van Tecoma stans teen 10 swampatogene.
Bepaling van sellulêre toksisiteitst

Die rede waarom ons die sitotoksisiteit van die ekstrak en oleanolsuur wou bepaal, is omdat, as die sitotoksisiteit laag is, daar ’n moontlikheid is dat dit gebruik kan word om swampatogene op eetbare plante te behandel. As die toksisiteit hoog is, is daar egter steeds ’n moontlikheid dat dit nuttig in die tuinboubedryf gebruik kan word (Eloff, Angeh & McGaw 2018).

Die selsitotoksisiteit van T. stans se DCM-ekstrak en verbinding is met die toksiese alkaloïed berberien as positiewe kontrole bepaal. Die sellewensvatbaarheid het toegeneem met ’n afname in konsentrasies van DCM-ekstrak, verbinding en berberien. Die hoogste konsentrasie van sowel DCM-ekstrak en verbinding het al die Vero-selle teen konsentrasies van hoër as 150 μg/mL doodgemaak. Berberien was toksies teen konsentrasies van hoër as 10 μg/mL.

Seltoksisiteit kan ook deur die LK50-waardes uitgedruk word. Die letale konsentrasie 50 is die konsentrasie wat tot die afsterwe van 50% van die selle lei. Dit word uit die regressiekurwe bereken. T. stans se DCM-ekstrak het ’n LK50 van 0.413 mg/mL gehad, die verbinding 0.129 mg/mL en berberien 15.48 mg/mL. Dit beteken dat die ruekstrak en oleanolsuur verskeie kere minder toksies was as berberien. Oleanolsuur was egter meer toksies teenoor Vero-selle as die ekstrak.

Die moontlike gebruik van Tecoma stans in plantproduksie

Baie antifungus verbindings is toksies omdat daar heelwat meer ooreenstemmende metaboliese weë tussen fungi en soogdiere is as tussen bakterieë en soogdiere. Daar is dus minder spesifieke teikens wat aangespreek kan word. Die belangrike vraag is hoe die toksisiteit van die teikenorganismes met die seltoksisiteit verband hou. Die selektiwiteitsindeks kan bereken word deur LC50 in (μg/mL)/MIK in (μg/mL).Hoe hoër hierdie waarde, hoe veiliger kan die produk onder beheerde toestande gebruik word (Tabel 3).

TABEL 3: Die selektiwiteitsindeks van ruekstrak en oleanolsuur teen 10 fungi.

Die ruekstrak se selektiwiteitsindeks teen die mikro-organismes T. harzianum, R. solani, F. oxysporium en P. expansum was hoog, naamlik 21. Dit beteken dat ruekstrak teen infeksie met hierdie fungi gebruik kan word en dat dit min toksisiteit oplewer as dit onder beheerde toestande gebruik word. Dit is interessant om daarop te let dat P. expansum, wat ’n groot probleem in die bederf van vrugte is, deur die ruekstrak teen ’n baie lae doseringsvlak en lae toksisiteit gebruik kan word. Fusarium-spesies, wat ’n groot probleem in die besmetting van mielies en die dood van saailinge kan wees, kan ook met ‘n lae dosis en toksisiteit beheer word.

Oleanolsuur se hoë selektiwiteitsindeks van 16 en 64 teen T. harzianum en R. solani onderskeidelik het uitgestaan as die mees belowende vir die gebruik van oleanolsuur teen infeksies wat deur hierdie twee fungi veroorsaak word – as dit teen die korrekte dosis gebruik word. By baie ander fitopatogene was die ekstrak of oleanolsuur meer toksies teen Vero-selle as teen die fungus.

Gevolgtrekking

Dit lyk asof daar ’n groter potensiaal vir die gebruik van plantekstrakte is as vir die geïsoleerde oleanolsuur. Dit sal baie minder kos om die ruplantekstrak te produseer. Daar was groot verskille in die verskillende patogene se sensitiwiteit teenoor die ruekstrak. Dit kan waardevol wees omdat dit daarop dui dat die aktiwiteit teen ’n basiese metaboliese middel is wat in al die fungi teenwoordig is.

Omdat baie swamdodende middels ook hoogs toksies is, was dit belangrik om die seltoksisiteit en die selektiwiteitsindeks te bepaal. Onder beheerde toestande kan die ruekstrak en oleanolsuur gebruik word teen infeksies wat deur sekere van die patogene veroorsaak word met ’n redelik goeie selektiwiteitsindeks. Dit bied dus ‘n relatiewe lae toksisiteitsbedreigings. In die geval van ander patogene sal nóg die ruekstrak nóg die oleanolsuur van enige waarde wees omdat dit toksies is. ’n Mens moet egter in gedagte hou dat die seltoksisiteit nie noodwendig met toksisiteit deur ander roetes toegedien aan diere verband hou nie. As die toksiese komponent ingeneem word en dit teen die lae pH in die ingewande vernietig word, of nie uit die ingewande in die bloed opgeneem word nie of vinnig ontgiftig word, kan die toksisiteit baie later wees. Dit is ook moontlik dat ’n meer toksiese verbinding ná die opname van die ekstrak kan ontwikkel, wat die belang van in vivo-eksperimente op diere beklemtoon. Dit val egter buite die bestek van hierdie werk.

Erkennings

Ons is dankbaar teenoor die kurator van die Laeveld Nasionale Botaniese Tuin wat ons toegelaat het om plantmateriaal te versamel. Prof. Lise Korsten (Departement van Plant Pathologie, Universiteit van Pretoria), wie die plant kultivar van die fitopatogene wat gebruik is, voorsien het. Hierdie navorsing is deur die Nasionale Navorsingstigting (NNS) en die Universiteit van Pretoria ondersteun.

Mededingende belange

Die outeurs verklaar dat hulle geen finansiële of persoonlike verbintenis met enige party wat hom nadelig of voordelig kon beïnvloed het in die skryf van hierdie artikel nie.

Outeursbydrae

M.M. het die werk as deel van ’n MSc-studie gedoen. L.M. het gehelp om die aktiewe verbinding te isoleer en die struktuur op te klaar. J.N.E. het die projek geïdentifiseer, die studieleiding gedoen en die manuskrip hersien en dit ingedien.

Literatuurverwysings

Awuah, R.T. & Kpodo, K.A., 1996, ‘High incidence of Apergillus flavus and aflotoxins in stored groundnut in Ghana and the use of a microbial assay to assess the inhibitory effects of plant extracts on aflatoxin synthesis’, Mycopathologia 134, 109–114. https://doi.org/10.1007/BF00436873

Eloff, J.N., 1998a, ‘Which extractant should be used for the screening and isolation of antimicrobial components from plants?’, Journal of Ethnopharmacology 60, 1–8. https://doi.org/10.1016/S0378-8741(97)00123-2

Eloff, J.N., 1998b, ‘A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts of bacteria’, Planta Medica 64, 711–714. https://doi.org/10.1055/s-2006-957563

Eloff, J.N., 2004, ‘Quantification of the bioactivity of plants extracts during screening and bioassay guided fractionation’, Phytomedicine 11, 370–371. https://doi.org/10.1078/0944711041495218

Eloff, J.N., Angeh, I.E. & McGaw, L.E., 2018, ‘Solvent-solvent fractionation can increase the antifungal activity of a Melianthus comosus (Melianthaceae) acetone extract to yield a potentially useful commercial antifungal product’, Industrial Crops and Products 111, 69–77. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2017.09.050

Eloff, J.N., Picard, J. & Masoko, P., 2007, ‘Resistance of animal fungal pathogens to solvents used in bioassays’, South African Journal of Botany 73, 667–669. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2007.06.002

Hammouda, Y. & Amer, M.S., 1966, ‘Antidiabetic effect of Tecomine and Tecostanine’, Journal of Pharmaceutical Sciences 55, 1452–1454. https://doi.org/10.1002/jps.2600551228

Hammouda, Y., Rashid, A.K. & Amer, M.S., 1964, ‘Hypoglycaemic properties of Tecomine and Tecostanine’, Journal of Pharmacology 16, 833–835. https://doi.org/10.1111/j.2042-7158.1964.tb07420.x

Holden, A.J., 1999, ‘Solvent and membrane extraction in organic analysis’, in A.J. Handely (ed.), Extraction methods in organic analysis, pp. 5–53, CRC Press, Boca Raton, FL.

Hostettman, K., Marston, A., Ndjoko, K. & Wolfender J.L., 2000, ‘The potential of African plants as a source of drugs’, Current Organic Chemistry 4, 973–1010. https://doi.org/10.2174/1385272003375923

Kotze, M. & Eloff, J.N., 2002, ‘Extraction of antibacterial compounds from Combretum microphyllum (Combretaceae)’, South African Journal of Botany 68, 62–67. https://doi.org/10.1016/S0254-6299(16)30456-2

Masoko, P. & Eloff, J.N., 2005, ‘The diversity of antifungal compounds of six South African Terminalia species (Combretaceae) determined by bioautography’, African Journal of Biotechnology 12, 1425–1431. https://doi.org/10.1016/j.jep.2005.01.061

Masoko, P., Picard, J. & Eloff, J.N., 2005, ‘Antifungal activities of six Terminalia species (Combretaceae)’, Journal of Ethnopharmacology 99, 301–308. https://doi.org/10.1016/j.jep.2005.01.061

Mosmann, T., 1983, ‘Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay’, Journal of Immunological Methods 65, 263–271. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4

Oleanolic acid, viewed 04 December 2008, from www.alibaba.com/product-gs/203129384/Oleanolic_acid.html

Prescott, L.M., Harley, J.P. & Klein, D.A., 1996, Microbiology, 3rd edn., W. C. Brown Publishers, Dubuque, IA.

Sharma, N. & Tripathi, A., 2006, ‘Fungitoxicity of the essential oil of Citrus sinensis on post-harvest pathogens’, World Journal of Microbiology and Biotechnology 22, 587–593. https://doi.org/10.1007/s11274-005-9075-3

Strange, R.N. & Scott, P.R., 2005, ‘Plant disease: A threat to global food security’, Annual Review Phytopathology 43, 83–116. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.43.113004.133839

Tecoma stans, viewed 04 December 2008, from http://cloudbridge.org/trees/tecomastans.htm

Tripathi, P. & Dubey, N.K., 2004, ‘Exploration of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables’, Postharvest Biology and Technology 32, 235–245. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2003.11.005

Bylaag 1:

FIGUUR 1-A1: Kernmagnetiese resonansiespektrum van ge´soleerde verbindings.